腺病毒载体的构建方法

体外连接法

将外源基因的表达盒亚克隆到腺病毒基因组的一个片段上,在体外与腺病毒的基因组相连,重新构建成一个完整的腺病毒DNA 分子,转染敏感细胞,即可获得重组腺病毒〔10〕。但腺病毒基因组上适宜于克隆的酶切位点有限,因而限制了该法的应用。目前,可利用该法构建全缺失载体。

同源重组法

实验中常将具有共同或重叠序列的两种DNA 分子,通过共转染转移到某一生物体内,在生物体内一系列与同源重组有关的酶的作用下,将DNA 片段由一个DNA 分子(常为含有外源基因的穿梭质粒) 转移到另一个分子(常为含有病毒骨架结构的质粒) 中去。生物体不同,构建载体的方法各异。在真核细胞中进行同源重组:分为哺乳动物细胞和酿酒酵母细胞两种。前者常用的为293 和911 细胞,源于人胚肾及人胚成视网膜细胞,已整合腺病毒基因,可表达腺病毒E1蛋白,用于增殖E1 区缺失的腺病毒载体。

构建时,需历经筛选及噬斑纯化等过程,效率低、费时,且技术条件要求高。已报道利用酿酒酵母细胞经过两次重组过程将外源基因置换到腺病毒的基因中,与哺乳动物细胞相比,用酿酒酵母细胞构建腺病毒载体有一定的优越性。例如,可用Southern 杂交技术直接鉴定酵母细胞克隆中是否含有腺病毒载体,易于获得重组的阳性克隆,但重组前要将完整的腺病毒基因组克隆到酵母人工染色体( YAC) 中,并需要从较大量(至少500 ml) 培养基中培养的酵母细胞里提取YACs ,重组时,要在拟重组的区域内,将腺病毒DNA 分子线性化,由于涉及的DNA 分子较大,做到此点有时也并非易事。

在原核细胞中进行同源重组:所有克隆的操作,尤其是同源重组的过程可利用大肠埃希菌高效的同源重组机制在工程菌(如BJ5183) 中完成,重组效率高,在转染真核细胞前已完成对病毒载体的鉴定工作,因而避免了反复鉴定及纯化的麻烦,大大缩短生产病毒载体的时间,可在20 d 内获得重组腺病毒〔14 ,15〕。目前,许多实验室正在利用该法制备重组腺病毒。

位置特异性重组

异源的位置特异性重组系统在哺乳动物细胞和动物中,早已被广泛应用。源于P1 噬菌体的Cre2LoxP 系统包括38 000 的重组酶(Cre) 和34 bp 的loxP 靶序列。Cre 重组酶可介导存在于同一条DNA 分子内部的两个相同的loxP 位点之间进行重组,使得嵌于位点间的序列被切除(顺式剪切作用) ,产生两个重组产物,各含一个loxP 位点。依据这一原理构建腺病毒载体的方法有两种。其一,对部分( E1) 缺失的腺病毒进行改造,以制备辅助病毒,即将其包装信号镶嵌于loxP 位点之间,然后与线性化的载体的穿梭质粒共转染能表达Cre 重组酶的293 细胞系,通过这种方法可获得克隆容量高达37 kb 的全缺失载体; 其二,首先构建含有两个loxP 位点的重组腺病毒,嵌于loxP 位点之间的序列为不含有顺式作用元件的腺病毒的编码区,可表达腺病毒的结构蛋白,然后将这种重组病毒感染能表达Cre 重组酶的293细胞,通过Cre 重组酶的顺式剪切作用,即可获得全缺失或部分缺失载体,这种载体的克隆容量约为10 kb。

由Cre 重组酶介导的上述顺式剪切作用过程是可逆的,即Cre 重组酶也可介导两个各含一个loxP 位点的分子(细菌质粒) 之间进行位点特异性重组,产生整合作用,但效率较低〔2〕。利用这种整合作用构建腺病毒载体已有文献报道。

Cre 重组酶为美国杜邦公司专利产品,国际上仅有为数不多的几家实验室享有使用这种重组酶的特权,因此以该酶为基础构建的腺病毒载体系统现在还难以推广。另外,载体的结构及包装效率不稳定, 使其大规模生产受到限制。但该法以其在载体构建上的高效性以及低辅助病毒污染等优点,已引起人们的重视。