慢病毒载体的发展史

早期HIV21来源的慢病毒载体

早期构建的HIV21 来源 的慢病毒载体,是作为研究HIV21生物特性的工具,而非作为基因转移载体。该慢病毒载体包含了完整的病毒基因组,仅仅是在env 基因框内插入了一个报告基因,由于存在病毒滴度较低,以及产生有复制能力的反转录病毒(RCR) 的巨大风险,这种载体从未被考虑用于基因治疗。但是,这种载体可以应用于病毒的生物学研究。

第一代HIV-1来源的慢病毒载体

以Naldini以及Kafri构建的三质粒系统为代表。该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3 种质粒组成。载体质粒携带了5′端LTR 和全部5′端非翻译区域(包括gag 编码序列的350 个核苷酸) ,另外还带有rev 应答元件(Rev responsive element ,RRE) 及3′端LTR。其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV) 启动子及增强子元件,在某些研究领域,可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因作为生物标记。包装质粒由HIV-1 前病毒基因组作简单修改得到,其5′端LTR 由异源病毒启动子/ 增强子元件取代。为了防止来自辅助质粒的RNA 衣壳化, 特意将5′端主要剪接供体位点 (splice donor site) 和gag 编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψ region) 删除,而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(poly A)取代。另外,利用点突变将env 编码序列打断,但仍然保留rev 反应元件。这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env除外) 。env 由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。本系统包膜质粒的改进之处在于,引入了VSV-G基因表达包膜结构,这样做的结果至少具有3个方面的积极意义: ①包膜的更换进一步降低了HIV-1 载体恢复成野生型病毒的可能; ②使HIV 载体感染宿主的范围不再仅限于CD4 + 细胞 ,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞; ③VSV 的包膜赋予HIV 载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。使HIV-1 载体滴度由105 转录单位(TU) / ml 达到 108TU/ ml 。这样的改进无疑是HIV 载体系统走向应用而迈出的一大步。

第二代HIV-1来源的慢病毒载体

尽管第一代载体产生RCR 的几率极小,仍然不能忽略产生的可能性。毕竟包装质粒可以表达除env 外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋白与HIV-1的毒力密切相关,且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用,比如:vpr 可引起细胞周期停滞,vif能抑制某些细胞的生长而Nef 能引起凋亡。1997年,Zufferey 等将包装质粒上的 vif 、vpr 、vpu 和nef 基因敲除,从而得到第二代慢病毒载体,而其他方面与上述第一代载体系统一致。研究发现即使全部4 个调节基因都被敲除。病毒颗粒的产量也不会受到影响。这种载体仍然具有体外感染非分裂期细胞、在体感染分化成熟大鼠神经元的能力,但是目前尚不能确定这种载体是否能转染全部种类细胞。由于敲除的调节基因与野生型HIV-1 病毒的生活周期以及毒力密切相关,所以这些载体即使发生多位点重组形成RCR ,亲代病毒仍不具有致病性。

第三代HIV-1来源的慢病毒载体

利用慢病毒来源的包装系统的最大问题在于生产过程中可能产生复制型病毒。当质粒DNA 转染进入包装细胞,以及辅助质粒及载体质粒的RNA 包装入同一病毒颗粒时,将有可能发生重组。减少这种可能性的方法之一就是减少辅助质粒与载体质粒的同源性。另一个方法便是将gag/ pol 和rev 编码序列隔离,分散在不同的质粒 。这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统。质粒一携带了gag/ pol 编码序列 及RRE;质粒二包含了编码rev 的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。采用四质粒代替三质粒系统、除去tat 均减少了产生复制型病毒的可能性,从而增加了载体系统的安全性。

自身失活型(SIN)慢病毒载体

由于具有逆转录方式的特点,在逆转录过程中存在于病毒基因组3′端U3 区的启动子/增强子元件将被复制,并置于前病毒两端的LTR。 因此,3′LTR 的U3 区启动子发生失活突变后,将在逆转录过程中转移至5′LTR。如果这样的载体整合入靶细胞,将不会产生完整长度的载体RNA ,因此命名为“自身失活型载体”。这种技术最先应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV) 载体和鸟类的脾坏死病毒(SNV) 载体。进一步研究表明 ,U3 区的频繁突变将导致病毒滴度下降,原因是该区域的某些序列是载体有效多聚腺苷酸化所必需的。在HIV-1 基因组内,核心多聚腺苷酸化信号存在R 区。现已证实,U3 区序列能影响多聚腺苷的酸化效率。与MoMLV 相比,将HIV-1的3′LTRU3 区(除上述多聚腺苷酸化增强相关序列,以及病毒整合酶识别的U3 区5′末端外) 删除后并不会影响滴度。这种删除能确保病毒RNA 逆转录并整合入靶细胞染色体后,从5′LTR 端启动子起始的复制被有效抑制。这种设计的另一个优势是 能增强瞬时表达效率,这可能与减少了病毒LTR 和细胞启动子之间的启动子竞争有关。